反相色譜是迄今在高效液相色譜儀中應用最廣泛的技術，主要是因為它適用于分析極大多數(shù)的非極性物質和很多的可離子化的及離子化合物。大多數(shù)用于反相色譜的固定相都是天然的疏水物質，因此，分析物是按照它們與固定相的疏水相互作用的大小來分離的，含有疏水的機制也能以同樣的保留方式分離.

       什么導致反相柱子污染產(chǎn)生？通常，樣品中含有一些對分析者來說不感興趣的東西。鹽、脂質、含脂物質、腐質酸、疏水蛋白質和其它一些生物物質是一些可能在使用時與HPLC柱發(fā)生相互作用的物質。這些物質有比分析者的目標物或少或大的保留值。那些保留值較小的物質如鹽類一般來說在空體積時就被沖出色譜柱。這些非目標產(chǎn)物的干擾能被檢測器檢測到而且能形成色譜峰，氣泡，基線上移或者是負峰。如果樣品成分在柱子中有很強的保留而且流動相溶液成分不足以把這些物質洗脫下來，多次上樣后，這些吸附在柱子表面的物質通常就會積累在柱頭。這些行為通常只有通過平行實驗才能發(fā)現(xiàn)。有著中等保留值的樣品能被緩慢洗出而且表現(xiàn)為寬峰，基線擾動，或者基線漂移。

       有時候這些被吸附的樣品成分累積到一定程度足以使他們開始形成新的固定相。分析物能與這些雜質作用形成一定的分離機理。保留時間會波動，拖尾會出現(xiàn)。如果足夠的污染產(chǎn)生，柱子的反壓能超過泵所能承受的最大壓力，使柱子無法工作以及在堵塞處產(chǎn)生空體積，再生被污染HPLC柱子的關鍵是知道污染物的性質并且能找到適當?shù)娜軇﹣砣コＨ绻廴臼且驗橹貜瓦M樣時強保留物質的累積引起的，利用簡單的步驟來除去這些污染物往往能恢復其色譜行為。有時候，經(jīng)過多次操作以后的色譜柱用90～100％的溶劑B（雙溶劑反相系統(tǒng)中較強的溶劑）沖洗20個體積可以清除污染物。例如，柱子中殘留的脂質就能用非水溶劑如甲醇、乙晴、四氫 呋喃。

    如果你使用的是緩沖液系統(tǒng)，不要直接切換到強溶劑，突然轉換到高濃度有機溶劑可能會使HPLC流動體系中的緩沖液沉淀，這樣會導致更大的問題如柱頭 堵塞、管道堵塞、泵泄漏、活塞損傷或進樣閥轉軸失靈。應該先用無緩沖流動相（即把緩沖液換成水）。沖洗5～10個體積以后才更換強溶劑。有時候，強溶劑也沒法把殘留在色譜柱上的污染物洗掉。那么更強的溶劑或者是一系列溶劑就有必要用來清洗柱子了，如果污染物是非生物物質，使用者可以跳過一個或多個另外的有機溶劑去除污染物。溶劑與溶劑之間的組合有很多。到柱子廠家的網(wǎng)頁上能找到推薦的溶劑系統(tǒng)。

       一般來說，所有的清洗方法都有類似的形式。所用的溶劑都是隨溶劑強度增加，經(jīng)常最后一個溶劑是非常疏水的（如醋酸乙酯甚至是烴），可以用來溶解非極性物質 如脂質和油類。我們必須保證一系列溶劑中每個溶劑都能與下一個溶劑互混。

        清洗過程要結束時，必須借助一個中等強度能互混的溶劑而回到原始溶劑系統(tǒng)。例如， 異丙醇是一個非常好的作為中間步驟的溶劑，因為它能與正己烷或二氯甲烷互溶又能與水相溶劑互溶。但是異丙醇粘度非常大，必須確保較低的流速以免使泵壓過高。

        當然，如果使用紫外檢測器的話，避免溶劑在紫外區(qū)域有吸收，要不然需使用大量的溶劑沖洗才能使基線平穩(wěn)。成功再生反相柱子是一個非常耗時間的過程，溶劑沖洗可以利用梯度系統(tǒng)過夜操作。